基因不是只有一个固定入口
许多哺乳动物基因拥有多个转录起始位点。不同启动子可以产生不同5'端、蛋白亚型或调控响应。数据库标注的“主要转录本”通常基于特定证据和版本，不保证在当前组织占主导。
研究者若把所有基因统一截取一个参考TSS上游序列，会混合真正活跃和未使用的启动子。
CpG岛与启动子类型有关
高CpG启动子常见于广泛表达基因，转录起始位置可能较分散；低CpG启动子更常呈现组织或条件特异性，但这不是绝对分类。
CpG岛存在只描述序列组成。甲基化、核小体、组蛋白标记和转录机器共同影响活动状态。
甲基化结果要回到细胞组成
组织样品包含多种细胞。观察到甲基化比例变化，可能来自某类细胞比例改变，也可能来自同一细胞内状态改变。没有细胞组成信息时，不应直接解释为启动子被打开或关闭。
单细胞或细胞分选资料可以缩小范围，但也带来覆盖与统计功效问题。
多个TSS让motif背景更复杂
若每个基因纳入多个启动子，长基因和转录本丰富的基因会贡献更多序列与候选位点。分析工具需要限制每个基因的贡献，避免结果被注释数量驱动。
cREMaG历史方法特别关注替代启动子和每个基因允许的TFBS数量，这类设计思想仍值得保留。
RNA-seq不能单独确定精确TSS
常规RNA-seq覆盖整个转录本，对5'端不一定充分。CAGE、RAMPAGE和专门5'端测序更适合定位起始位点。只根据外显子覆盖推断启动子，可能把相邻转录本或降解信号混在一起。
多种资料一致时才能逐步提高信心，缺少直接证据时应把TSS写成候选。
版本记录决定结果能否重做
分析文件应保存基因组组装、注释版本、TSS来源、CpG岛算法、窗口和筛选条件。只保存最终基因列表，无法解释未来数据库更新后出现的差异。
版本不是行政细节，而是启动子坐标与motif结果的一部分。
启动子切换可能改变蛋白质而不只改变表达量
如果替代启动子改变第一外显子或开放阅读框，最终蛋白可能拥有不同N端、定位信号或调控结构域。只看基因总表达量，会把两种功能不同的转录本加在一起。研究药物反应、发育或肿瘤样品时，启动子使用比例有时比总量变化更接近机制。
判断这种变化需要转录本层级读段、5端证据和蛋白结构信息共同支持。短读长RNA-seq在共享外显子很多时难以区分亚型，长读长转录组可以补充完整结构，但仍要考虑测序错误和样品覆盖。
CpG岛边界来自算法定义
CpG岛不是显微镜下可直接看到的固定物体，而是根据GC比例、CpG观察值与期望值、长度等规则划出的序列区域。不同算法和版本可能给出略有差异的边界，因此报告“启动子位于CpG岛”时应说明所用注释。
边界差异会影响甲基化探针、测序窗口和富集统计。一个位点落在岛边缘、shore或shelf时，不同分类方法可能给出不同标签。把原始坐标保留下来，比只保存分类名称更耐用。
组织特异性需要真实样品证据
参考数据库通常整合许多组织，某个TSS被收录只说明曾有证据，不代表它在当前样品活跃。肝、脑、免疫细胞和胚胎阶段可能选择不同启动子。分析前若能取得同组织CAGE、ATAC或转录本资料，应优先用来缩小候选范围。
缺少对应资料时，可以保留多个可能启动子并做敏感性分析：分别计算富集，再观察核心结论是否随TSS选择改变。若变化很大，启动子选择本身就是结果限制。
调控变异必须对应正确转录入口
全基因组关联研究发现的非编码变异，常通过最近基因被快速命名，但真实调控目标可能更远。启动子切换、染色质环和细胞类型特异性会让“最近”失去解释力。
把变异与启动子连接时，可结合可及性、eQTL、染色质互作和转录因子占位。证据不足时应写成候选关联，不把距离关系直接升级为因果。
增强子与启动子的配对不是固定最近原则
增强子可以跨越很长距离与启动子接触，也可能绕过最近基因。染色质互作资料提供空间接近线索，eQTL提供个体差异关联，CRISPR干预则更接近功能检验。任何单一证据都可能包含多个候选目标。
启动子发生切换后，同一增强子的有效配对也可能改变。研究者应保留细胞类型、刺激条件和所用互作分辨率，不能把一个细胞系的环结构当作所有组织的固定连线。
疾病样品中的启动子变化需要正常参照
疾病与对照之间的启动子差异可能受到年龄、药物、细胞比例和组织保存影响。若对照来源与处理流程不同，技术差异会进入调控解释。
理想设计包含匹配对照、独立验证队列和同一流程。资料有限时，应把可能混杂因素列入结论边界，而不是只保留显著的启动子。
结论
多个TSS让同一基因拥有不同调控入口。研究报告把活跃启动子的证据、CpG状态和注释版本分开记录，才能避免把参考模型误当成所有组织的固定事实。